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試劑盒:顯色和比色分析

 更新時間:2018-08-27 點擊量:1823
   試劑盒:顯色和比色分析
  在試劑盒實驗中各種酶標(biāo)儀性能都會有所不同,所以在使用中應(yīng)詳細閱讀說明書,再進行下一步操作。
  自從20世紀(jì)60-70年代問世以來,Elisa法得到*科研工作者的認(rèn)可及推崇,在歐美及中國獲得很大的推廣,尤其是國內(nèi)生化領(lǐng)域的長足發(fā)展。試劑盒有著準(zhǔn)確性高、靈敏度高、特異性強等很多的優(yōu)點,它在檢測抗體、抗原等方面有很好的應(yīng)用,深受廣大用戶朋友的喜愛。然而,在實驗過程中,也需要注意很多問題,特別是顯色、比色問題。
  顯色
  顯色是ELISA中的一步溫育反應(yīng),此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi),陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中,加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測定的顯色可在室溫進行,時間一般不需要嚴(yán)格控制,有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時間,及時判斷。
  OPD(鄰苯二胺)底物顯色一般在室外溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深,再延長反應(yīng)時間,可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色,顯色反應(yīng)應(yīng)避光進行,顯色反應(yīng)結(jié)束時加入終止液終止反應(yīng)。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后,顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。
  TMB(四甲基聯(lián)苯胺)受光照的影響不大,可在室溫中置于操作臺上,邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性,宜在規(guī)定的適當(dāng)時間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后,約40分鐘顯色達,隨即逐漸減弱,2小時后即可*消退無色。TMB的終止液有多種,疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-24小時)不褪,是目視判斷的良好終止劑。此外,各類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色,此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。
  比色
  比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體,然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗,需先將板置于標(biāo)準(zhǔn)96孔的座架中,才可進行比色。在加底物液顯色前,先將軟板邊緣剪凈,這樣,此板就可*平妥坐入座架中。
  比色時應(yīng)先以蒸餾水校零點,測讀底物孔(未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔)和空白孔(以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔),以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點,以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度,然后進行計算。
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