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細胞培養(yǎng)常見問題及對策

 更新時間:2022-04-18 點擊量:1660

1 冷凍管應(yīng)如何解凍?

取出冷凍管后,須立即放入 37 C 水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在 1 鐘內(nèi)全部融化,并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時,必須注意安全,預(yù)防冷凍管之爆裂。

細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時,是否應(yīng)馬上去除 DMSO?

除少數(shù)特別注明對 DMSO 敏感之細胞外,絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞),在解凍之后,應(yīng)直接放入含有 10-15ml 新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中,待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除 DMSO  即可,如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基?

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細胞培養(yǎng)基,若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基,細胞大都無法立即適應(yīng),造成細胞無法存活。

可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類?

不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源,所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清,在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

何謂 FBS, FCS, CS, HS ?

FBS (fetal bovine serum) FCS (fetal calf serum)  是相同的意思,兩者都是指胎牛血清, FCS 乃錯誤的使用字眼,請不要再使用。CS (calf serum)  則是指小牛血清。HS (horseserum)  則是指馬血清。

培養(yǎng)細胞時應(yīng)使用 5 % 10% CO2?或根本沒有影響?

一般培養(yǎng)基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作為 pH 的緩沖系統(tǒng),而培養(yǎng)基 NaHCO3 的含量將決定細胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的 CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升 3.7 g 時,細胞培養(yǎng)時應(yīng)使用 10% CO2;當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升 1.5 g 時,則應(yīng)使用 5% CO2 培養(yǎng)細胞。

何時須更換培養(yǎng)基?

視細胞生長密度而定,或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時間,按時更換培養(yǎng)基即可。

培養(yǎng)基中是否須添加抗生素?

除于特殊篩選系統(tǒng)中外,一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

附著性細胞繼代時所使用之 trypsin-EDTA 濃度?應(yīng)如何處理?

一般使用之 trypsin-EDTA 濃度為 0.05% trypsin-0.53m MEDTA.4 Na。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中,保存于20 C,避免反復(fù)冷凍解凍造 trypsin 之活性降低,并可減少污染之機會。

10 懸浮性細胞應(yīng)如何繼代處理?

一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中,稀釋細胞濃度即可,若培養(yǎng)液太多時,可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高,直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶,加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度, 重復(fù)前述步驟即可。

11 欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速?


欲回收動物細胞,其離心速率一般為 300xg ( 1,000rpm),5 - 10 分鐘,過高之轉(zhuǎn)速,將造成細胞死亡。

12 細胞之接種密度為何?

依照細胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

13 細胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何?

動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含 5 - 10% DMSO (dimethyl

sulfoxide)  90 - 95 %原來細胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意:由于

DMSO 稀釋時會放出大量熱能,故不可將 DMSO 直接加入細胞液中,必須使用前先行配制完成。

14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何?

冷凍保存使用之 DMSO 等級,必須為 Tissue culture grade DMSO (Sigma D2650),其本身即為無菌狀況,第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中,保存于 4 C,避免反復(fù)冷凍解凍造成 DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì),并可減少污染之機會。若要過濾 DMSO,則須使用耐 DMSO Nylon 材質(zhì)濾膜。

15 冷凍保存細胞之方法?

冷凍保存方法一:冷凍管置于 4 C 30~60 分鐘 → (-20 C 30 分鐘) -80 C16~18 小時(或隔夜) → 氮槽 vapor phase 長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機中每分鐘降 1-3 C 80 C  以下, 再放入液氮槽 vapor phase 長期儲存。*-20 C 不可超過 1 小時,以防止冰晶過大,造成細胞大量死亡,亦可跳過此步驟直接放入-80 C 冰箱中,惟存活率稍微降低一些。

16 細胞欲冷凍保存時,細胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細胞濃度?

冷凍管內(nèi)細胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial,融合瘤細胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。

17 應(yīng)如何避免細胞污染?

細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染的好方法。

18 如果細胞發(fā)生微生物污染時,應(yīng)如何處理? 加入相應(yīng)抗生素,直接滅菌后丟棄之。

19 支原體(mycoplasma) 污染的細胞, 是否能以肉眼觀察出異狀?

不能。除極有經(jīng)驗之專家外,大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株,無法以其外觀分辨之。

20 支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響?

支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù),代謝及研究任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前,必須確認細胞為 mycoplasma-free,實驗結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。

        21 細胞株有支原體污染時, 該如何處理? 

直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細胞株。

22 CO2 培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔?

定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。



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