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PCR引物設(shè)計的關(guān)鍵點有哪些?

 更新時間:2023-10-16 點擊量:938

PCR引物是人工合成的一段寡聚核苷酸。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,因此,PCR的首要任務(wù)就是引物設(shè)計。那么你知道PCR引物設(shè)計的關(guān)鍵點有哪些嗎?讓我們一起來看看吧!

一、引物最好在模板cDNA 的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計

DNA序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的。在NCBI上搜索不同物種的同一基因,通過序列分析軟件(比如DNAman)比對(Alignment),各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū)。

二、引物長度一般在15~30 堿基之間

引物長度(primer length)常用的是18-27 bp,但不應(yīng)大于38,因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃,不適于Taq DNA 聚合酶進行反應(yīng)。

三、引物GC 含量在40%~60%之間,Tm 值最好接近72℃

GC含量(composition)過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外,上下游引物的Tm值(melting temperature)是寡核苷酸的解鏈溫度,即在一定鹽濃度條件下,50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。有效啟動溫度,一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm= 4(G+C)+2(A+T)估計引物的Tm 值,則有效引物的Tm為55~80℃,其Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。

四、引物3′端要避開密碼子的第3 位

如擴增編碼區(qū)域,引物3′端不要終止于密碼子的第3位,因密碼子的第3位易發(fā)生簡并,會影響擴增的特異性與效率。

五、引物3′端不能選擇A,最好選擇T

引物3′端錯配時,不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異,當(dāng)末位的堿基為A 時,即使在錯配的情況下,也能有引發(fā)鏈的合成,而當(dāng)末位鏈為T 時,錯配的引發(fā)效率大大降低,G、C 錯配的引發(fā)效率介于A、T 之間,所以3′端最好選擇T。

六、引物應(yīng)具有特異性

引物設(shè)計完成以后,應(yīng)對其進行BLAST 檢測。如果與其它基因不具有互補性,就可以進行下一步的實驗了。

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