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逆轉(zhuǎn)錄酶怎么選?

 更新時間:2023-12-15 點擊量:965
  逆轉(zhuǎn)錄酶(Reverse Transcriptase)是一種用于從RNA模板生成互補DNA(cDNA)的酶,是cDNA合成和RT-qPCR反應中的核心酶,其合成的cDNA可以直接作為PCR,qPCR,LAMP和測序等檢測的模板。那么你知道該如何選擇逆轉(zhuǎn)錄酶嗎?讓我們一起來看看吧!
  一、逆轉(zhuǎn)錄酶活性
  逆轉(zhuǎn)錄酶主要包括以下三種活性:
  ①逆轉(zhuǎn)錄活性:以RNA為模板,催化dNTP聚合,生成DNA-RNA雜合雙鏈。
 ?、赗Nase H活性:水解雜合雙鏈中的RNA,得到與RNA互補的DNA單鏈(cDNA)。
  ③DNA指導的DNA聚合酶活性:以cDNA單鏈為模板,以dNTP為底物,再合成雙鏈DNA。
  二、決定最佳逆轉(zhuǎn)錄酶的幾個關(guān)鍵重要特性
  1.熱穩(wěn)定性
  耐高溫能力是cDNA合成的一個重要方面,因為高溫有助于使具有強二級結(jié)構(gòu)和/或高GC含量的RNA變性,從而實現(xiàn)全長cDNA合成和更高產(chǎn)量。
  野生型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶在37°C下表現(xiàn)最佳,而加工改造后的熱穩(wěn)定性MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶可以承受高達55°C的溫度,而不會對逆轉(zhuǎn)錄效率產(chǎn)生負面影響。
  2.RNase H活性
  RNase H(核糖核酸酶H)是一種切割并降解RNA-DNA雜交鏈中RNA鏈的酶,同時可以保持DNA鏈的完整。
  如果逆轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性過高,則會導致RNA模板的過度降解,引起cDNA合成不完整或效率低下。具有低RNase H活性的逆轉(zhuǎn)錄酶可以最大限度地減少反應中RNA分子的非特異性降解,提高cDNA合成的特異性和保真度。
  由于RNA模板在全長逆轉(zhuǎn)錄完成之前可能被降解,RNase H活性是長片段cDNA合成過程中需要規(guī)避的因素。RNase H活性還可能會與逆轉(zhuǎn)錄酶中的活性聚合酶競爭從而降低逆轉(zhuǎn)錄效率。為了更好地合成cDNA,通過在逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H結(jié)構(gòu)域中引入突變,逆轉(zhuǎn)錄酶的RNase H活性降低甚至完q消除。這種突變常??梢栽黾娱L鏈cDNAs的產(chǎn)量,促進其合成。
  3.持續(xù)合成能力
  持續(xù)合成能力是指在酶的單個結(jié)合事件中摻入的核苷酸數(shù)量。持續(xù)合成能力強的逆轉(zhuǎn)錄酶可以在更短的反應時間內(nèi)合成更長的cDNA鏈。大多數(shù)經(jīng)過改造的逆轉(zhuǎn)錄酶具有更強的合成能力(比野生型MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶高65倍)。
  更多有關(guān)逆轉(zhuǎn)錄酶的選擇問題,請聯(lián)系北京百奧創(chuàng)新科技有限公司。
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