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MLPA試驗(yàn)原理

 更新時(shí)間:2024-08-12 點(diǎn)擊量:874


MLPA技術(shù),即多重連接探針擴(kuò)增技術(shù),于2002年首先報(bào)道,是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種針對(duì)待檢DNA序列進(jìn)行定性和半定量分析的新技術(shù)。該技術(shù)高效、特異,在一次反應(yīng)中可以檢測(cè)45個(gè)核苷酸序列拷貝數(shù)的改變,已經(jīng)應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域、多種疾病的研究。下面讓我們一起來(lái)看看MLPA技術(shù)的試驗(yàn)原理吧!

MLPA實(shí)驗(yàn)中,純化的樣本DNA被變性。后用MLPA探針寡核苷酸孵育過(guò)夜。每個(gè)MLPA探針都具有針對(duì)特定基因組序列的探針。每對(duì)MLPA探針包括兩條單鏈DNA:左側(cè)探針和右側(cè)探針寡核苷酸。簡(jiǎn)稱(chēng)分別是LPORPO。LPORPO包含PCR引物和DNA雜交序列。

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MLPA反應(yīng)中,左探針寡核苷酸(LPO)和右探針寡核苷酸(RPO)都與靶序列進(jìn)行雜交,之后使用連接酶連接兩部分探針。

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將雜交的探針寡核苷酸連接到鄰近的目標(biāo)序列。探針連接產(chǎn)物的數(shù)量是樣品中目標(biāo)序列數(shù)量的度量。連接反應(yīng)具有高度特異性,連接部位周?chē)?/span>沒(méi)有錯(cuò)配。

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使用單個(gè)通用引物對(duì)在多重PCR中擴(kuò)增連接的探針。只有連接的探針呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增,使得不需要去除未連接和未連接的探針。

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再通過(guò)毛細(xì)管電泳進(jìn)行片段分離,通過(guò)MRC Holland分析軟件進(jìn)行分析得出結(jié)論。PCR產(chǎn)物裝載到毛細(xì)管電置上,按長(zhǎng)度分離。每個(gè)片段對(duì)應(yīng)一個(gè)特定的MLPA探針。

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MLPA結(jié)合了DNA探針雜交和PCR技術(shù),不僅可以用來(lái)檢測(cè)與疾病相關(guān)的CNV(?拷貝數(shù)變異)?,?例如遺傳性乳腺癌、?結(jié)腸癌、?杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良等,?還可以用于腫瘤中的CNV檢測(cè),?以?xún)?yōu)化腫瘤分型。任何技術(shù)都有其優(yōu)缺點(diǎn)。

優(yōu)點(diǎn):

1、高效:一次反應(yīng)可以檢測(cè)45個(gè)靶序列拷貝數(shù)的改變。

2、特異:可以檢測(cè)點(diǎn)突變。

3、快速:一次實(shí)驗(yàn)可以在24小時(shí)內(nèi)完成。

4、簡(jiǎn)便:不同的試劑盒操作基本相同,容易掌握。

缺點(diǎn):

1、需要精確測(cè)量DNA的濃度,樣本容易被污染。

2、不能用于單個(gè)細(xì)胞的檢測(cè)。

3、MLPA用于檢測(cè)基因的缺失或重復(fù),不適合檢測(cè)未知的點(diǎn)突變類(lèi)型。

4、不能檢測(cè)染色體的平衡易位。


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