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一文了解Solarbio索萊寶WB-考馬斯亮藍(lán)染色法

 更新時(shí)間:2024-08-20 點(diǎn)擊量:2094

一、Solarbio索萊寶WB-考馬斯亮藍(lán)結(jié)構(gòu)

考馬斯亮藍(lán)R-250G-250染料是二磺酸化三苯基甲烷化合物的兩種化學(xué)形式,結(jié)構(gòu)上R-250G-250少了2個(gè)甲基。命名上“R"Red的縮寫,因R-250的藍(lán)色染料呈微紅色;命名上“G"Green 的縮寫,因G-250的藍(lán)色染料泛淺綠色,也稱為膠體考馬斯亮藍(lán)(見下文);“250"表示考馬斯亮藍(lán)的純度。

一文了解Solarbio索萊寶WB-考馬斯亮藍(lán)染色法

其中R-250因少兩個(gè)甲基,與蛋白質(zhì)反應(yīng)比較緩慢,染色耗時(shí)較長,但是容易被洗脫下去,所以常用作凝膠電泳中蛋白質(zhì)條帶染色的基礎(chǔ)染料。而G-250因?yàn)槎鄡蓚€(gè)甲基,與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)十分迅速,且形成有色復(fù)合體較為穩(wěn)定,不容易洗脫,常用于蛋白定量的Bradford 法測定試劑;也可染膠,但其脫色時(shí)間較長、脫色困難,背景較高,長時(shí)間在水中脫色容易使凝膠吸水膨脹甚至破碎。

二、Solarbio索萊寶WB-考馬斯亮藍(lán)染色蛋白質(zhì)染料要求

用染料和生物大分子結(jié)合形成有色的復(fù)合物是電泳后檢測的方法。選用染料通常應(yīng)考慮以下要求:
1. 必須與大分子結(jié)合以形成一個(gè)不溶性的,有色的,緊密的復(fù)合物,但不結(jié)合到凝膠中和支持膜上,以便從凝膠中除去,否則高背景會影響蛋白帶的辨別和定量掃描。
2. 染料必須容易溶解在對大分子沒有影響的溶劑中,以利于背景的脫色。
3. 選用高吸光系數(shù)的染料有利于提高定量測定的靈敏度。
4. 選用能與大分子有專一性結(jié)合的染料,并在結(jié)合后能產(chǎn)生不同的顏色(如熒光),可以提高檢測的選擇性和靈敏度。

早期用于蛋白染色的染料是氨基黑10B,是一種含有兩個(gè)磺酸基團(tuán)的酸性重氮化合物,所以能與堿性氨基酸殘基結(jié)合進(jìn)而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)染色。但其對SDS-蛋白質(zhì)染色效果不好;此外,氨基黑10B對不同蛋白質(zhì)染色時(shí),著色度不等、色調(diào)不一(有藍(lán)、黑、棕等);染色靈敏度低,進(jìn)行凝膠定量掃描時(shí),誤差較大。 考馬斯亮藍(lán)染料是二磺酸化三苯基甲烷化合物,每個(gè)分子也含有兩個(gè)磺酸基團(tuán),也能與堿性氨基酸殘基結(jié)合進(jìn)而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)染色,其次,還可通過染料的疏水性殘基和蛋白質(zhì)的疏水性區(qū)域的作用產(chǎn)生疏水性力,同時(shí)也存在氧鍵和范德華力的作用??捡R斯亮藍(lán)染色靈敏度比氨基黑高5倍, 并且適用于SDS-PAGE電泳微量蛋白質(zhì)染色,此外與不同蛋白結(jié)合呈現(xiàn)基本相同的顏色,并且在比較寬的范圍內(nèi) ,掃描峰的面積與蛋白量有線性關(guān)系。

三、Solarbio索萊寶WB-考馬斯亮藍(lán)染色考染的應(yīng)用

考馬斯亮藍(lán)又稱為Bradford法,是一種常用的蛋白定性定量分析方法。其主要利用Coomassie Brilliant Blue G-250這種酸性染料與蛋白質(zhì)在酸性環(huán)境下產(chǎn)生吸附,導(dǎo)致染料的最大吸光波長從465 nm變?yōu)?/span>595 nm。通過制備不同濃度的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品液,Bradford試劑混合后測定其595 nm吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。與標(biāo)準(zhǔn)品同量的樣品蛋白溶液與Bradford試劑混合。5 min后在595 nm波長下測定各樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出各樣品的蛋白濃度。

此外,考馬斯亮藍(lán)(Coomassie Brilliant Blue)與麗春紅染色一樣,也是WB實(shí)驗(yàn)中常用的染色方法。通常情況下考馬斯亮藍(lán)用于染SDS-PAGE凝膠以評估電泳和轉(zhuǎn)膜條件是否合適(在電泳完成后染色可以根據(jù)凝膠上條帶的位置形狀初步判斷蛋白的遷移情況;在電轉(zhuǎn)完成后進(jìn)行該染色可初步判斷蛋白是否有殘留,幫助實(shí)驗(yàn)人員判斷轉(zhuǎn)膜條件是否合適),而麗春紅染色則主要用于染膜以初步評估轉(zhuǎn)膜效率及不同組間蛋白表達(dá)情況。

一文了解Solarbio索萊寶WB-考馬斯亮藍(lán)染色法

四、Solarbio索萊寶WB-考馬斯亮藍(lán)染色步驟

1)電泳結(jié)束后,將膠板取出放入加有超純水的平皿中潤洗,以去除殘留電泳液。

2)之后加入考馬斯亮藍(lán)染液浸沒,放至水平搖床室溫30 min或更長時(shí)間進(jìn)行染色(具體根據(jù)凝膠厚度和溫度進(jìn)行調(diào)整),直至凝膠與染色液顏色十分接近。

3)棄去染色液或回收染色液(可回收使用3次左右)。

4)脫色直至背景清晰。

五、Solarbio索萊寶WB-考馬斯亮藍(lán)部分產(chǎn)品表

貨號

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

P1305

考馬斯亮藍(lán)染色套裝

1Kit

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