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細(xì)胞周期檢測的實(shí)驗(yàn)原理和方法

 更新時間:2024-10-08 點(diǎn)擊量:972

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從上一次分裂完成開始,到下一次分裂完成時為止,包括兩個階段:分裂間期和分裂期。細(xì)胞周期檢測的是單個細(xì)胞的增殖速度,通過縮時攝影來測定。

一、實(shí)驗(yàn)原理

細(xì)胞在不同的時期,細(xì)胞所含的DNA量不同。正常細(xì)胞的二倍體含量通常為2N則在G/G1期,細(xì)胞的DNA量為2N,G2M期細(xì)胞DNA含量為4N。SDNA量為2N-4N。碘化丙錠(PI)可以與細(xì)胞內(nèi)的DNARNA結(jié)合,通過RNA酶將RNA消化后,檢測到與DNA結(jié)合的P熒光強(qiáng)度可以直接反映細(xì)胞內(nèi)DNA含量的多少。因此,采用流式細(xì)胞術(shù)PI染色法檢測細(xì)胞內(nèi)DNA含量時,可將細(xì)胞周期分為G/G1期、S期和G2/M期,并通過特殊軟件計算各時相的百分比。

二、實(shí)驗(yàn)方法

測定細(xì)胞周期的方法常見的同位素標(biāo)記法、流式細(xì)胞儀、基于細(xì)胞成像的熒光檢測法等。

1.同位素標(biāo)記法

標(biāo)記有絲分裂百分率法 (PLM) 是一種常用的測定細(xì)胞周期時間的方法。其原理是對測定細(xì)胞進(jìn)行脈沖標(biāo)記、定時取材、利用放射自顯影技術(shù)顯示標(biāo)記細(xì)胞,通過統(tǒng)計標(biāo)記有絲分裂細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的辦法來測定細(xì)胞周期。

檢測原理:

① 待測細(xì)胞經(jīng) 3H- 胸腺嘧啶核苷標(biāo)記后,所有 S 期細(xì)胞均被標(biāo)記。

S 期細(xì)胞經(jīng) G2 期才進(jìn)入 M 期,所以一段時間內(nèi) PLM = 0

③ 開始出現(xiàn)標(biāo)記 M 期細(xì)胞時,表示處于 S 期最后階段的細(xì)胞,已渡過 G2 期,所以從 PLM = 0 到出現(xiàn) PLM 的時間間隔為 G2的持續(xù)時間。

S 期細(xì)胞逐漸進(jìn)入 M 期,PLM 上升,到達(dá)到最高點(diǎn)的時候說明來自處于 S 最后階段的細(xì)胞,已完成 M,進(jìn)入 G1 期。所以從開始出現(xiàn) M PLM 達(dá)到最高點(diǎn) (100%) 的時間間隔就是 M 期的持續(xù)時間。

⑤ 當(dāng) PLM 開始下降時,表明處于 S 期最初階段的細(xì)胞也已進(jìn)入 M 期,所以出現(xiàn) LM PLM 又開始下降的一段時間等于 S 期的持續(xù)時間。

2.流式細(xì)胞儀 PI 染色法

細(xì)胞周期分為間期與分裂期兩個階段。間期又分為三期:即 DNA 合成前期 ( G1 )DNA 合成期 ( S ) DNA 合成后期 ( G2 )。某些細(xì)胞在分裂結(jié)束后暫時離開細(xì)胞周期,停止細(xì)胞分裂,執(zhí)行一定生物學(xué)功能 ( G0 )。

檢測原理:

由于細(xì)胞周期各時相的 DNA 含量不同,通常正常細(xì)胞的 G1 / G0 期具有二倍體細(xì)胞 DNA 含量 ( 2N ),而 G2 / M 期具有四倍體細(xì)胞的 DNA 含量 (4N),而 S 期的 DNA 含量介于二倍體和四倍體之間。PI可以與 DNA 結(jié)合,其熒光強(qiáng)度直接反映了細(xì)胞內(nèi) DNA含量。因此,通過流式細(xì)胞儀 PI 染色法對細(xì)胞內(nèi) DNA 含量進(jìn)行檢測時,可以將細(xì)胞周期各時相區(qū)分為 G1 / G0 期,S 期和 G2 / M期,獲得的流式直方圖對應(yīng)的各細(xì)胞周期可通過特殊軟件計算各時相的細(xì)胞百分率。

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3.基于成像的熒光檢測法

FUCCI (fluorescent ubiquitination-based cell-cycle indicator) 小球能鑒別細(xì)胞處在細(xì)胞周期的哪一時期,因此可以用來研究癌癥細(xì)胞周期的進(jìn)程。FUCCI 技術(shù)建立在鑒定過表達(dá)的兩種調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的蛋白 geminin Cdt1 水平上,其中 geminin 融合的是綠色熒光基團(tuán) AmCyan,而 Cdt1 融合的是紅色熒光基團(tuán) mCherry。Cdt1 geminin 的水平隨著細(xì)胞周期的變化而不斷波動:Cdt1 蛋白水平在 G1 階段達(dá)到峰值,而 geminin 蛋白水平在 S,G2 M 期不斷升高。這一結(jié)果體現(xiàn)為表達(dá) FUCCI 細(xì)胞核在G1 期為紅色而在 S,G2 M 期則呈現(xiàn)綠色。

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